近两年，生物学研究方法上频频出现了两个词“类器官”“单细胞分析”，如果这两个词撞一起，将会碰撞出什么样的火花 ，看看大牛用热门技术研究老通路 MAPK，真的有料！
听说“类器官”和“单细胞分析”技术比较火，小编也来凑个热闹。最近，Nature Cell Biology 刊登的题为 Quantifying single-cell ERK dynamics in colorectal cancer organoids reveals EGFR as an amplifier of oncogenic MAPK pathway signaling 的研究，作者团队通过 ERK 生物传感器 EKAREN5 监测结肠直肠癌 (CRC) 类器官中的单细胞 ERK 水平动态变化，揭示了有致癌突变的 MAPK 通路信号中，上游的 EGFR 是关键的信号放大因子。该研究用到了类器官和单细胞分析技术，还涉及了 MAPK 这条复杂的信号通路，当两大技术撞上一大通路，“好戏”即将上演！类器官 (Organoids) 技术：类器官是细胞衍生的体外 3D 器官模型，可在模拟内源性细胞组织和器官结构的环境中研究生物学过程，例如细胞行为、组织修复以及对药物或突变的反应。重要的是，3D 体外模型保留了体内肿瘤的组织病理学特征，包括患者特异性药物反应。类器官是一项重大技术突破，在药物筛选、疾病建模、基因编辑和移植方向的应用都表现出巨大的潜力。
图 1. 类器官被 Nature Methods 选为 2017 年度最佳方法[一般类器官的建立：多能干细胞 (PSC/ASCs) 或切碎的组织块在含有细胞外基质 (小肠上皮类器官建立可用 Lgr5+ 干细胞代替) 和相应器官生长需要的生长因子的 3D 培养基，即组织特异性的生长微环境中培养，驱动干细胞形成类器官的组织结构。目前已经有多种建立类器官的方法，科研人员已经成功建立了肠道、大脑、胃、肝等多种不同组织的类器官。]
单细胞分析：随着生物学研究的不断深入，细胞间异质性的探讨是必然的趋势，因此，在单细胞水平上基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学和细胞间相互作用的研究越来越重要，单细胞分析如单细胞测序技术、单细胞免疫印迹技术等成了必不可少的研究手段。
图 2. pan-HER 抑制剂 Afatinib 作用于 MAPK 信号通路
MAPK 信号通路十分复杂，由于正、负反馈的存在，下游 ERK 信号动力学表现出振荡 (Oscillatory) 特质，即脉冲波动。单细胞 ERK 动态监测肿瘤组织的药物反应有助于我们对靶向治疗反应的认知。而KRAS 或 BRAF 突变 CRC 肿瘤中， EGFR 传导的信号和 KRAS 和 BRAF 突变两者诱导的 ERK 活化动力学仍有疑问，例如两者谁起核心作用，为了探究这个问题，Hugo J. G. Snippert 教授的团队用 ERK 生物传感器检测 CRC 类器官中的单细胞 ERK 活性。
■ 监测 CRC PDOs 中单细胞 ERK 的药物应答
为了了解具有突变的 MAPK 途径的人类肿瘤中的药物反应，作者团队重新设计了 ERK 生物传感器 EKAREN5 来捕获 CRC PDOs 中单细胞 ERK 图谱的动态性质。
首先，作者团队建立了 MAPK 通路中包含致癌突变的类器官 PDO-KRASG12C、PDO-KRASG12V、PDO-KRASG12D、PDO-NRASQ61H 和 PDO-BRAFV600E 以及 MAPK 通路中没有突变的类器官。并通过 MEK 抑制剂 (Selumetinib) 、ERK 抑制剂 (SCH772984) 以及 PMA 和 大田软海绵酸 (Okadaic acid) 对传感器进行单细胞 ERK 活性标准化，便于进行 PDO 品系之间比较分析。
图 3. CRC 类器官中单细胞 ERK 动态揭示了 MAPK 通路抑制剂处理下细胞间具有异质性
监测 PDO-KRASG12V 中 MEK 抑制剂 Selumetinib 药物应答，在处理前，几乎所有细胞都表现出广泛的 ERK 自主波动，类似于在健康小鼠小肠类器官中观察到的波动，揭示了野生型/突变型 MAPK 信号传导的 CRC PDOs 广泛存在 ERK 活性振荡。Selumetinib 处理后，ERK 信号受到抑制，值得注意的是，Selumetinib 处理 2 小时后，发现有少量细胞发生 ERK 重激活，比之前报道的细胞培养中 ERK 的重激活要快很多，高浓度的 Selumetinib 处理，重激活的频率和幅度下降。有趣的是，ERK 的重激活显示出细胞之间的异质性，即使相邻细胞之间也存在显着差异。同样的，pan-RAF 抑制剂 LY3009120 处理的 PDO-BRAFV600 中同样观察到了细胞间异质性。
■ PDOs 中 HER 的抑制消除了 ERK 活性振荡
在 PDO-KRASG12V 中抑制上游 EGFR 后监测 ERK 活性动态。尽管下游存在突变的 KRAS，低浓度的 pan-HER 抑制剂阿法替尼 (Afatinib) 处理仍能立即并大幅度抑制 ERK 活性的波动，pan-HER 抑制剂(Lapatinib、Dacometinib) 以及 EGFR 特异性抑制剂 (Gefitinib、Erlotinib、Cetuximab) 同样抑制了 ERK 活性波动，而 HER2 特异性抑制剂 CP-724714 则没有。在其他突变和野生型类器官中也观察到了 Afatinib 诱导的 ERK 活性波动消除。这些数据表明，尽管在 KRAS 或 BRAF 中有致癌性突变，EGFR 仍然是人类 CRC 肿瘤细胞中 ERK 活性的主要驱动力。
图 4. Afatinib 消除了 KRAS、NRAS 或 BRAF 突变 PDOs 中的 ERK 活性波动
值得注意的是，残余的 ERK 活性在抑制上游信号后变得很明显，缺乏振荡特性，很可能反映的是突变 RAS 或 RAF 的构成的致癌信号。通过 LY3009120 处理 RAS 突变型 PDOs，细胞中上游鸟苷酸交换因子 (GEFs) 结构域失常，以及 AMG-510 (KRASG12C 选择性抑制剂) 处理降低的 PDO-KRASG12C，结果表明 EGFR 持续参与突变型 MAPK 信号传导，突变的 KRAS 分子参与 EGFR 介导的 ERK 活化。因此，ERK 活性驱动由来源于致癌基因的有限的基础信号，加上大很多的 EGFR 驱动的脉冲信号组成。长期剥夺 EGF 的情况下，所有 RAS 突变 PDOs 的 ERK 自主波动谱在很大程度上未发生变化，而总体 ERK 磷酸化状态仅轻微降低。RAS 突变体中 ERK 波动对 Afatinib 敏感，其中BRAF 突变体与 RAS 突变体的反应，但最终结果表明这些 PDOs 建立了自分泌和/或旁分泌的 EGFR 刺激。尽管限制了 EGF，大多数 CRC PDOs 仍保持 ERK 活性振荡模式，可能是旁分泌或微环境衍生的 EGFR 刺激物仍可以支持致癌 MAPK 信号放大，从而促进肿瘤生长，这点也与多种 CRC 的 PDX 模型推论结果一致。因此，EGFR 的抑制对抑制致癌 MAPK 信号必不可少。
图 5. 长期剥夺 EGF 条件下，突变型 PDOs
长时间的泛 HER 抑制剂抑制了突变型 PDOs 中 EGFR 驱动的 ERK 水平振荡，降低了突变型 PDOs 的生长水平，但不影响其存活，而 EGFR 的信号放大作用则促进细胞增殖。有趣的是，将 Afatinib 与 LY3009120 联合使用可消除致癌基因驱动的 ERK 活性，从而导致 PDO-KRASG12C 死亡率增加。
图 6. Afatinib+LY3009120 消除了阻止了所有突变型 PDOs 的增殖
最后，他们通过 PDX 小鼠模型 (人源肿瘤异体移植模型) 中验证，得到了相同的结论：EGFR 的激活放大了下游致癌 MAPK 效应因子的信号传导。
总结：
靶向 KRAS 或 BRAF 突变 CRC 需要“垂直靶向”包括多个效应因子，包括上游的 EGFR，其负反馈激活是抑制下游后产生耐药性的机制。总的来说，该实验通过类器官中单细胞 ERK 水平的动态监测，揭示了 EGFR 信号放大了致癌 MAPK 效应因子 (如 RAS，BRAF) 的信号传导，为以上的概念提供了有力的理论支持。
值得一提的是，该研究应用 PDO 技术是体外稳健的 3D 技术，它保留了体内肿瘤的病理学特征，包括患者特异性药物反应，对临床前药物筛选、个性化药物和药物开发具有重要意义，它与 PDX 有同样的临床关联性，并兼具活细胞成像的即时细胞药物反应。因此，研究证明了通过药理性靶向 EGFR 来抑制信号放大过程，是 MAPK 突变 CRC 靶向治疗的重要一步。
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PSCs: either pluripotent stem cells
ASCs: multipotent organ-specific adult stem cells
MAPK：The mitogen-activated protein kinase
ERK：Extracellular-regulated kinase
EGFR：Epidermal growth factor receptor
PDOs：Patient-derived organoids
FRET：fluorescence resonance energy transfer1. Bas Ponsioen, Hugo J. G. Snippert, et al. Quantifying single-cell ERK dynamics in colorectal cancer organoids reveals EGFR as an amplifier of oncogenic MAPK pathway signaling. Nat Cell Biol. 2021 Apr;23(4):377-390.2. Kai Kretzschmar, Hans Clevers. Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish. Dev Cell. 2016 Sep 26;38(6):590-600. 3. Frans Schutgens, Hans Clevers.Human Organoids: Tools for Understanding Biology and Treating Diseases. Annu Rev Pathol. 2020 Jan 24;15:211-234.